一般說明

堿性磷酸酶（ALP或AKP）是廣泛分布于人體肝臟、骨骼、腸、腎和胎盤等組織經(jīng)肝臟向膽外排出的一種酶。這種酶能催化核酸分子脫掉5’磷酸基團(tuán)，從而使DNA或RNA片段的5’-P末端轉(zhuǎn)換成5’-OH末端。但它不是單一的酶，而是一組同工酶，堿性磷酸酶在堿性環(huán)境中催化磷酸酯水解，形成有機(jī)自由基和無機(jī)磷酸鹽。該測試?yán)?span style="font-family: Arial;">4-甲基傘形酮磷酸酯被ALP水解成高熒光產(chǎn)物4-甲基傘形酮。熒光增加的速率與酶活性成正比。檢測限度為0.02 U/L。

適用性

直接測定：血清、血漿和其他來源中的ALP 活性。

藥物發(fā)現(xiàn)：ALP調(diào)節(jié)劑的高通量篩選。

試劑盒組成

反應(yīng)試劑：7mL      100x 標(biāo)準(zhǔn)液：120mL

儲(chǔ)存: -20°C。

樣品制備

ALP在4°C下可穩(wěn)定48小時(shí)，在 -20°C下可穩(wěn)定2個(gè)月。 EDTA、草酸鹽、氟化物、檸檬酸鹽是已知的ALP抑制劑，應(yīng)避免在樣品制備中使用。血清、血漿（無EDTA/檸檬酸鹽，最好是未溶血的）和細(xì)胞培養(yǎng)基可以直接檢測。使用前將所有試劑解凍至室溫。該測定基于動(dòng)力學(xué)反應(yīng)。建議使用多通道移液器。向樣品中添加試劑應(yīng)迅速，混合應(yīng)短暫而徹di。可在室溫或37°C下進(jìn)行檢測。

檢測步驟

1. 標(biāo)準(zhǔn)：首先將5mL的100x 標(biāo)準(zhǔn)液與495mL蒸餾水混合以獲得1x 標(biāo)準(zhǔn)液。將 0、3、6 和 10mL 1x標(biāo)準(zhǔn)品轉(zhuǎn)移到黑色96孔板的單獨(dú)孔中，并分別向每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)孔中加入10、7、4 和 0mL蒸餾水，使每個(gè)體積達(dá)到10mL。

樣品： 將10mL樣品轉(zhuǎn)移到孔板的單獨(dú)孔中。

2. 使用多道移液器，將 90 mL反應(yīng)試劑添加到所有標(biāo)準(zhǔn)和樣品孔中。快速輕敲孔板以混合，并在所需溫度（例如 25°C）下孵育所需的時(shí)間（例如20分鐘）。

3.讀取熒光強(qiáng)度（l_exc= 360nm, l_em = 450nm）。

4. 計(jì)算：根據(jù)每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)在20分鐘時(shí)測量的熒光值，繪制曲線確定斜率。 樣品的 ALP 活性為：

F_樣本和 F_空白是樣品和空白（即沒有標(biāo)準(zhǔn)液孔）的熒光值。 t 是反應(yīng)時(shí)間（例如 20 分鐘）。 n 是稀釋倍數(shù)。 如果計(jì)算值高于 10 U/L，則使用較短的孵育時(shí)間，或用水稀釋樣品并重復(fù)測定。 將結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)n。

單位定義：1 個(gè)單位 (U) 的 ALP 在 pH 10.5 和室溫 (25°C) 下催化 1mmole的 4-甲基傘形酮磷酸酯轉(zhuǎn)化為 4-甲基傘形酮。

注意事項(xiàng)：

1. 對于ALP活性較低的樣品（< 1 U/L），建議將孵育時(shí)間延長至例如60分鐘。

2. 對于384孔分析，反應(yīng)體積可以縮小，對于比色皿分析，反應(yīng)體積可以放大。

3. 本產(chǎn)品僅供研究用，使用過程中應(yīng)嚴(yán)格遵循實(shí)驗(yàn)安全措施。