T4 Polynucleotide Kinase（T4 PNK）

貨號(hào)：T5206  

保存：-20℃保存。

規(guī)格：500U

組成：

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

T4 Polynucleotide Kinase（T4 PNK），中文名稱 T4 多聚核苷酸激酶，是一種多聚核苷酸5'-羧基激酶，能夠催化ATP的 γ 磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到寡核苷酸鏈（雙鏈或單鏈DNA 或者 RNA）或3'-單磷酸核苷上的5'-羥基末端，且該反應(yīng)過程可逆。此外，T4 PNK還具有3'磷酸酶活性，可以將3'-磷酸基團(tuán)從寡核苷酸的3'-磷酸末端、脫氧3'-單磷酸核苷和脫氧3'-二磷酸核苷上水解掉。

活性定義

1 活性單位 (U) 定義為在 1× T4 PNK Buffer 中，37℃、30 min 內(nèi)使 1 nmol 的 [γ-³² P] ATP 摻入酸不溶性沉淀物所需要的酶量。

產(chǎn)品應(yīng)用

1. 對(duì) DNA 或 RNA 5' 末端進(jìn)行磷酸化，以便進(jìn)行連接反應(yīng)。

2. DNA 或 RNA 的末端標(biāo)記，用作探針和進(jìn)行 DNA 測(cè)序。

3. 除去 3' 磷酸基團(tuán)。

質(zhì)量控制

蛋白純度

經(jīng) SDS-PAGE 凝膠電泳檢測(cè)，蛋白純度不低于 95%。

非特異性內(nèi)切酶活性

37℃下，在 20 μl 反應(yīng)體系中將 10 U T4 Polynucleotide Kinase 與200 ng超螺旋質(zhì)粒DNA 共同溫育 4 h，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)， 少于20%的質(zhì)粒DNA 轉(zhuǎn)變成缺刻或線性狀態(tài)。

DNase 活性

37℃下，在 20 μl 反應(yīng)體系中將 10 U T4 Polynucleotide Kinase與15 ng 雙鏈DNA 片段共同溫育 16 h，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，雙鏈DNA 片段無變化。

RNase 活性

37℃下，在 10 μl 反應(yīng)體系中將 10 U T4 Polynucleotide Kinase 與500 ng RNA共同溫育 1 h，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，超過 90%RNA 保持完整。

宿主 DNA 殘留

采用中國(guó)藥典 2020 版四部通則 3407 外源性 DNA 殘留量測(cè)定法第三法定量PCR 法，本品中大腸桿菌宿主細(xì)胞 DNA 殘留量低于 1 拷貝/10 U。 

使用方法

1. DNA 5' 末端磷酸化：

a. 10 × T4 PNK Buffer 不含 ATP，需自行準(zhǔn)備。

①將上述體系充分混勻后，37℃溫育 30 min；

②反應(yīng)完成后，75℃溫育 10 min 使 T4 Polynucleotide Kinase 失活。

2. DNA 5' 末端標(biāo)記：

b. 10× T4 PNK Buffer 不含放射性標(biāo)記的 ATP ，需自行準(zhǔn)備。

①將上述體系充分混勻后，37℃溫育30 min；

②反應(yīng)完成后，75℃溫育 10 min 使 T4 Polynucleotide Kinase 失活。

注意事項(xiàng)

1. 金屬離子螯合劑、磷酸鹽、銨根離子、大于 50 mM 的 KCl 和 NaCl 均可顯著抑制 T4 Polynucleotide Kinase 的活性。

2. 聚乙二醇 (PEG) 和亞精胺可改善磷酸化反應(yīng)的速率和效率。

3. 提高 ATP 的濃度可讓缺口磷酸化。切刻位點(diǎn)不能有效地磷酸化。CTP、GTP、TTP、UTP、dATP 及 dTTP 均可以替代 ATP 作為磷酸供體。

4. T4 Polynucleotide Kinase 使用時(shí)宜置于冰上，使用完畢后立即放置于-20℃保存。